1. PCR이란? 구성요소, 원리, 과정, 조성, protocol, 레시피

Ÿ   PCR이란? 

Polymerase Chain Reaction (중합효소 연쇄반응)의 약자로, DNA 증폭 (복제) 기술이다. 
적은 양의 DNA template 로 대량의 DNA를 얻을 수 있다. 
이를 이용하여 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에 중요한 역할을 하고 있다. 
 
 

Ÿ   PCR 구성 요소

1.     DNA, RNA template : 증폭 대상이 되는 DNA, RNA
2.     PCR Primers : 증폭할 부분을 잡는 짧은 염기서열
3.     Taq polymerase : 열에 특별히 강한 유전자 합성효소
(Thermus aquaticus 라는 온천에 사는 세균의 DNA polymerase, 72℃가 최적 온도, 94℃에서도 안정함)
4.     dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) : 유전자를 합성하는 재료가 되는 각 nucleotide
5.     MgCl2 : MgCl2는 dNTP와 복합체를 형성하여 효소활성, primer annealing 등에 관여
 

Ÿ   PCR 과정

1.      DNA denaturation

• 90℃~96℃로 가열하여 두가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 분리.
• 일반적으로 94℃사용 : 높은 온도일수록 단일가닥 DNA로 잘 이행되지만 온도가 너무 높으면 Taq DNA polymerase 역시 activity가 낮아짐.
• 첫 cycle에서는 확실한 변성을 위하여 약 5분간 지속시킴.
• 이 후의 cycle에서는 약 1 분간 (20-30sec) denaturation 시킨다.

 
2.      Primer annealing

• 50℃~65℃에서 진행, primer의 Tm값에 따라 결정 (기본 55℃)
• 30 sec~ 1min
• 염기 간의 결합은 G, C의 경우 세 군데에서 수소결합이 일어나고 A, T는 두 부분에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합 온도 결정.
• Primer design할 때 Annealing temperature를 고려해야 함.
• 일반적으로 GC content가 50%가 되는 Primer 쌍을 이용하는 것이 바람직.

 
3.      DNA polymerization, extension

• 68℃~74℃에서 진행 (polymerase 종류에 따라 다르며 Taq DNA polymerase 의 경우 72℃)
• 1 min ~ 1 min 30 sec
• Taq DNA polymerase의 합성 속도: 2000~4000 nucleotides/min
• 1 kb 마다 1 min 정도의 시간을 배당
• 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장할 수 있음
• Cycle이 계속 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려가는 것도 좋은 방법, 마지막 cycle 에는 약 10분 정도 시간을 충분히 주어서 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 함.

 
Ÿ  Cycle number : 대부분의 경우 25-35 cycles을 진행하고 template 분자가 10개 이하인 경우에는 40 cycles 정도 진행한다. 그러나 cycle의 수를 무작정 늘린다고 해서 product의 양이 급격하게 늘지는 않으며 오히려 비특이적 밴드가 늘어날 수도 있다.
 

Ÿ   PCR 실험 시 유의하여야 할 사항

1.     Pipetting & DNA template

• 여러 component를 혼합할 때에는 시료간에 오염이 되지 않도록 주의하여야 한다.
• 이론적으로 Taq DNA polymerase는 최적 온도 이하에서도 반응이 어느 정도 진행됨으로 상온 등에서 정학하게 annealing 되지 않은 primer에 의한 임의의 반응이 진행됨으로써 원하는 size의 product이외의 non-specific product가 만들어질 수 있다.

2.     PCR cycling program

• Initial denaturation
• Template DNA의 완전

3.     Equipment ( Thermocyclers & PCR tubes)
4.     PCR reaction components
 
*Hot start PCR
Ÿ   Modified form of Polymerase chain reaction (PCR) which avoids a non-specific amplification of DNA by inactivating the taq polymerase at lower temperatures.
Ÿ   Taq1 polymerase는 37℃에서도 그 활성이 좋기 때문에 간혹 가다가 첫 번째 denaturation 과정이 완전히 진행되기도 전에 Primer가 DNA molecule에 붙어서 extension이 일어나는 경우가 있다. 이렇게 낮은 온도에서 annealing이 일어날 경우 primer가 mismatch할 확률이 높고 따라서 결과적으로 정확도가 떨어지는 band를 얻게 된다. 이것을 막는 방법이 Hot start PCR을 이용하는 것이다. Hot start PCR에서는 primer가 정확하게 원하는 DNA site에만 붙을 수 있도록 충분한 온도가 된 후에 PCR이 일어나도록 필요한 물질 (polymerase, MgCl2, dNTP)을 넣어준다. (그 전에는 넣지 않는다) 결과적으로 mismatch를 피할 수 있으며 상대적으로 clear한 band를 얻을 수 있다.
 
 

Ÿ  일반적인 조성 

total 50ul reaction 기준으로 
DNA template               50~100ng 
primer (10pmol/ul) forward  1.5 ul 
primer (10pmol/ul) reverse  1.5 ul 
dNTP (each 2.5mM)               4 ul
10X Taq buffer                       5 ul
Taq polymerase                  0.2 ul
dH2O                           up to 50ul 
 
*primer GC content 가 많아지면 DMSO를 1~5 ul 추가 
(DNA secondary structure를 감소시켜주는 역할)
*KOD 등 buffer에 MgCl2가 포함되지 않는 경우 추가 
 
 

Ÿ  PCR setting 

PCR product size 1kb 기준
95℃    3:00
95℃    0:30     --┐
55℃    0:30      30 cycles 
72℃    1:00     --┘
72℃    10:00
16℃    ∞
 
 

Ÿ PCR 1x buffer

10mM tris-HCl pH8.5-8.8
50mM KCl
2mM MgCl2
(DMSO 2%)