유전자 재조합 DNA cloning (1) Gateway cloning - Entry clone 만들기

1. 원리 

bacteriophage λ가 bacteria의 chromosome에 삽입되는 과정의 site-specific recombination이라는 방식을 cloning에 적용.

attP (bacteriophage λ) + attB (bacteria) ⇆  attL, attR

 

 

1-1. BP cloning 

Gateway cloning (Image from  Plasmid 101: Gateway Cloning )

Expression vector 에서 혹은 PCR product를 이용하여 Entry clone을 만드는 반응. 

attB (PCR) + attP (Donor vector) → attR + attL (Entry vector)

 

25 bp의 attB site를 가진 primer를 이용하여 amplify 된 PCR product를 entry vector 에 넣는다. 

attB1  5’ – GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTNNN…

attB2    5’ – GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTNNN

증폭된 DNA는 attP site를 가지고 있는 pDONR vector 와 BP clonase를 이용하여 반응을 시키면 entry vector 가 완성된다. 

1-2. LR cloning 

Gateway cloning (Image from  Plasmid 101: Gateway Cloning )

Expression clone을 만들기 위한 반응. 

attL (Entry vector) + attR (Destination vector) → attP + attB (Expression vector)

 

2. Entry clone 만들기

방향성이 중요하므로 Entry vector 에 forward 로 잘 넣는 것이 중요함.

사용할 destination vector 의 종류에 따라서 (N-terminal or C-terminal tagging) 

start codon 이나 stop codon을 넣어주어야 한다. 

 

예를 들어 pDEST-X-GFP vector 에 LR cloning을 하려고 한다면 

entry vector 들어가는 gene은 start codon 을 가지고 있어야 하며 (+kozak sequence) 끝에 stop codon은 제거되어야 한다. 

1) BP reaction을 통한 cloning 방법 (pDONR...)

2) TOPO® TA 혹은 TOPO® Directional vector를 이용한 방법 (PCR8/GW/TOPO...)

3) 제한 효소를 이용한 ligation 방법 (pENTR...)

4) Premade clone을 구매하여 사용하는 방법

5) Custom service를 이용한 방법