competent cell 정의, 종류

competent cell (수용성 세포)란? 

외부의 DNA를 삽입할 수 있도록 물리적, 화학적으로 처리한 세포 

 

Transformation 

competent cell에 외부 DNA가 삽입되는 과정

 

출처: GOLDBIO. Competent cell에는 외부 플라스미드가 들어갈 수 있다.

 

 

화학적 방법 

• CaCl2나 MgCl2 등 salt를 이용하여 negative charge를 띄고 있는 DNA를 neutralization 시켜주는 방법.
• 고이온 농도에서 키운 세포에 DNA를 넣고 heat shock (42℃)을 주면 DNA가 세포 안으로 삽입되게 된다.  

 

물리적 방법

• 전기 pulse를 이용하여 세포막 막전위 변화를 주어 DNA 투과를 높이는 방법. 

 

Competent cell 종류 

1. 유전자 생산

 - DH5a : 가장 흔하게 사용되는 E.coli. recA1 mutation 으로 인하여 높은 insert stability를 가지고 있다. endA mutation으로 인하여 많은 양과 좋은 퀄리티의 DNA를 얻을 수 있다. Transformation 효율 (>1 x 10^6 cfu/µg) 이 좋다. 

 

 -Top10 : 가장 흔하게 사용되는 E.coli. 높은 transformation 효율 (>1 x 10^9 cfu/µg)  을 가지고 있음. supercoiled DNA 나 플라스미드의 안정적인 복제를 가능하게 한다. 

 

 - T1R : ccdB 유전자 산물 저항성을 가지고 있어 gateway vector cloning에 사용

 

 

2. 단백질 생산 

- BL21(DE3) : 과잉 생산된 단백질을 분해하는 Lon, OmpT 단백질 분해효소가 결여되어 있어 지속적으로 단백질 생산 가능. 박테리오파지 T7 프로모터를 인식하여 유전자를 발현시키는 T7 RNA 중합효소 유전자를 가지고 있음. T7 또는 T7-lac 프로모터 또는 E.coli RNA 폴리머에이스에서 인식하는 프로모터(예: lac, tac, trc, ParaBAD, PrhaBAD 및 T5 프로모터)로부터 발현에 적합.

 

 - BL21: Lon, OmpT 단백질 분해효소가 결여되어 있어 지속적으로 단백질 생산 가능. T7 RNA 폴리머에이스 유전자를 운반하지 않으므로 E.coli RNA 폴리머에이스에서 인식하는 프로모터(예: lac, tac, trc, ParaBAD, PrhaBAD 및 T5 프로모터)로부터 발현에만 적합.

 

 

 

기타 

• recA1 : ATP가 존재하는 상황에서 단일 가닥 DNA의 가수분해를 촉매하며 DNA 손상을 복구하는 것에 관여한다. recA1 mutation은 recA1 G160을 D (aspartic acid) 로 바꾸면 재조합효소의 활성을 억제하고 상동 재조합을 불활성화 시킨다. 
• endA : DNA 복제 후 생성된 단일 가닥 DNA를 분해하는 효소. endA mutation은 세포 내 endonuclease를 불활성화하여 플라스미드 정제 과정에서 이 효소가 플라스미드를 분해하지 못하도록 한다. 
• T7 RNA polymerase : T7 박테리오 파지의 RNA 중합효소로 T7 promoter에 특이적으로 결합하여 DNA로부터 RNA 합성을 촉매한다. 
• T7 promoter : T7 RNA polymerase 유전자를 발현시키는데 사용되는 강력한 프로모터. ITPG와 인도제에 의하여 활성화 된다. IPTG의 추가로 T7 프로모터가 활성화되면 T7 RNA polymerase는 T7 DNA를 RNA로 전사시키기 시작하며 대상 유전자의 mRNA 생성으로 이어진다. T7 프로모터는 매우 강력하며 높은 수준의 단백질 발현을 가능하게 하므로 대량의 단백질 생산이나 특정 유전자의 고수준 발현에 사용된다. 
• Lon: 불균일한 단백질을 대상으로 하는 ATP 의존적 단백질 분해효소로서 불필요하거나 손상된 단백질을 분해하여 세포 내 단백질의 질적 균형을 유지하는데 기여한다. 
• OmpT: 외막 단백질의 하나로, 특정 펩티드 결합을 가수분해하는 단백질 분해효소이다. 외부 단백질을 제거하는 기능을 한다.