Western Blot (1) SDS-PAGE

단백질의 발현 여부를 보기위하여 주로 하는 실험이다. 

일단 원리는 단백질의 사이즈에 따라 분리하고 antibody 로 특정 단백질을 확인하는 것이다. 

 

먼저 SDS-PAGE에 대하여 알아보겠다! 

 

전체적인 과정은

1. protein sample 준비

2. gel 준비.

3. gel running 

4. Transfer

5. blocking 

6. Antibody incubation

7. detection and visualization

으로 이루어진다. 

 

 

1. Protein sample 준비 

보통 세포나 조직등에서 protein lysis buffer를 이용하여 protein sample을 얻는다. 

 

단백질은 각각 다른 특성을 가지고 다른 cellular environment 를 가지므로 실험 목적에 맞는 적합한 buffer 를 사용하도록 한다.

이 때 고려해야 할 점은 pH, ionic strength, usage of detergent, preventative measure for proteolytic processess 등이 있다. 

lysis buffer의 조성 

• Tris-HCl (pH7.4) : 약산, 약염기가 들어 왔을 때 pH가 변하지 않도록 하는 완충제 역할. 강산 등은 사용 불가
• Triton X-100 : 비 이온성 세제로써 막 단백질 복합체를 분해시키기 위해 용해시키는 역할
• EDTA : Metalloprotease (Zn을 포함하는 protease) 활성 억제
• NaCl : 효소나 세포 활성에 맞도록 이온 세기를 맞춰 주는 역할. 

실험 목적이나 준비된 세포의 양에 따라 다르지만 

6-well plate 를 기준으로 lysis buffer 는 200~400ul 정도 넣어주면 된다.

그 다음 scraper 를 이용하여 cell 을 잘 긁어 모아주고 1.5ml E-tube로 옮긴다.

4℃ 로터에서 10~20분간 돌려주면 더 좋다. 

12000rpm 에서 10분간 centrifuge 를 진행하여 cell debris 를 피하여 상층액만 모은다. 

-> sample 완성, Heating or 냉동보관 

 

IP를 진행할 예정이라면 lysis buffer 에서 SDS 는 빼야한다. 

 

 

2. Gel 만들기 

 

protein sample을 준비하며 또 준비해야 할 것이 있다면 gel 이다. 

 

SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 를 진행하기 위함인데 

gel 의 구성성분 부터 알아보면서 그 원리를 알아보겠다. 

 

Gel 의 구성성분

Ÿ  SDS (sodium dodecyl sulfate) : native protein 을 polypeptides로 denature시킨다.

단백질 주위에 달라붙어 단백질의 구조를 풀게 하는 계면 활성제

SDS 처리를 하면 단백질의 입체구조가 풀어지면서 모양의 차이로 인한 이동 속도의 변화를 없애 준다.

또 SDS가 단백질에 달라 붙으면서 단백질이 (-) charge를 띄게 되어 electrophoresis에서 (+)쪽으로 이동할 수 있게 된다. 단백질이 모두 (-) charge를 띄므로 오직 분자의 크기에 의해서만 속도 차이가 생기고 이를 이용하여 분리 할 수 있다.

 

Ÿ  Mercaptoethanol : 단백질의 disulfide 결합 (-s-s-)를 환원시킨다.

시스테인 간의 이황화 결합을 깨서 삼차 구조를 풀게 한다.

 

Ÿ  Acrylamide : 농도를 이용하여 단백질의 이동속도 조절

Polymerization 과정을 거쳐 polyacrylamide가 되면 gel이 만들어 진다.

농도가 높아지면 gel 내부의 그물구조가 더욱 촘촘해지며 더 작은 단백질을 분리할 수 있다. -> 농도에 따라 통로의 크기를 조절할 수 있어 다양한 size의 분자를 분리해 낼 수 있다.

Acrylamide는 유해물질이므로 주의 하도록 한다.

Ÿ  Ammonium Persulfate (APS) : acrylamide로부터 자유 radical을 발생시키기 위함이다. free rdical은 acrylamide와 disacrylamide의 중합체를 형성한다.

 

Ÿ  TEMED : polyacrylamide 중합반응에서 촉매로 사용 되며 gel을 응고시킨다.

 

 

 

Gel 종류

Ÿ  Stacking gel : loading한 sample들이 농축되어 running gel에 들어가기 전에 같은 출발선 상에 위치하도록 하는 효과

Buffer 속의 glycine ion이 낮아진 pH로 인해 (-)전하를 잃게 된다. 그때 chloride ion과 glycine ion사이에 전류 gradient가 발생하여 protein의 이동이 빨라진다.

큰 단백질도 작은 단백질처럼 이동이 빨라지게 된다.

이동순서 : chloride > protein > glycine

 

Ÿ  Running gel : 단백질이 크기 별로 분리된다.

pH가 다시 높아져 glycine ion이 (-)전하를 다시 띄게 되며 단백질이 크기에 따라 이동하게 된다.

이동 순서 : chloride > glycine

 

 

Gel 만들기 

확인하고자 하는 단백질의 크기에 따라서 gel 의 %를 정한다. 

 

https://www.bio-rad.com/

그 다음 gel 만드는 cast 를 조립하고 % 에 맞추어 gel 을 만들면 된다. 

gel 한개당 running gel은 10ml, stacking gel은 3~4ml 정도 만들면 된다. 

running gel을 붓고 난 다음에는 물을 추가적으로 위에 넣어주면 gel이 일자로 bubble 없이 잘 만들어 진다.

running gel이 굿으면 위의 물을 제거하고 stacking gel을 부어주고 그 다음에는 원하는 사이즈의 comb을 꽂으면 된다.

bubble이 생기지 않게 주의하며 피부에 튀지 않도록 조심하는 것이 좋다. 

 

 

 

3. Gel running

 

SDS-PAGE electrophoresis, wikipedia

 

만들어진 gel을 잘 조립하고 sample을 로딩하면 gel running 을 시작한다.

보고자 하는 단백질 사이즈에 따라서 다르지만 

보통 stacking gel 80V 20분 

running gel 120V 80분하면 적당하다. 

(150~160V 1시간도 좋음) 

 

4. Transfer 

Transfer 란?

SDS-PAGE를 통해 분리한 단백질을 membrane으로 옮기는 과정이다.

Antibody가 gel 안으로 들어가는 것이 어렵기 때문에 transfer를 한다.

 

단백질이 SDS로 인해 (-) charge를 띄는 성질을 이용하는데 gel 쪽을 (-), membrane 쪽을 (+)로 하여 단백질에 전기장을 걸어 gel에 있는 protein을 membrane 쪽으로 이동시킨다. 

 

*열이 많이 나므로 냉각장치를 사용하도록 한다. 

 

Transfer는 방향에 잘 맞춰서 순서에 맞춰서 하면 되는데!

버블이 생기지 않도록 조심!해야 한다. 

Use of RNA Interference to Study DNA Repair (2014)

(Holder cassette 모양으로 자국이 남았던 적이 있는데 paper 두장으로 바꿨더니 해결되었다.)

 

membrane 의 종류 

 

1. NC membrane (Nitrocellulose)

장점

• 한번에 많은 antibody 흡착이 가능하다.
• 가격이 경제적
• non-specific binding에 대한 차단이 빠르고 간단하다.
• methanol-activation 과정이 필요없다.
• southern, nothern, western blot이 모두 가능.
• Fluorescent detection 가능
• 0.2um, 0.1um이 공급되어 작은 사이즈의 단백질의 blotting에도 유용하다. 

 

단점

• 재질이 hydrophilic하여 protein이 membrane에 붙는 힘이 상대적으로 약하다. 
• reproving 과정에 의해 protein이 잘 떨어질 수 있어 2회 이상 하기에 적합하지 않다.
• 재질이 약해 오래 보관하기에 좋지 않다.

 

2. PVDF membrane (Polyvinylidene fluoride)

장점

• specfic 결합으로 sharp band를 형성한다.
• 재질적 견고함과 결합력으로 강한 washing도 견딘다.
• membrane이 쉽게 상하지 않는다.
• 단백질 결합 능력이 크다.
•  

단점

• NC membrane에 비하여 비싸다
• NC에 비해 stripping이 잘 되지 않는다.
• metahnol activation 과정이 필요하다. (hydrophobic surface를 가진 PVDF원단 특징이 transfer 가 가능하도록 hydrophilic하게 변환시키기 위한 과정)
• western blot만 가능.

 

3. Nylon

장점

• NC보다 물리적으로 더 강한 힘을 제공한다.
• 단백질의 부착능력이 더 우수하다.
•  

단점

• non-hydrophobic transfer membrane 

 

 

5. Blocking

 

membrane에서 sample protein이 transfer 되지 않은 부분이 다른 단백질로 오염되는 것을 방지하여 background가 생기는 것을 막아준다.

 

SKIM milk나 BSA같은 blocking solution에 있는 protein들이 membrane에서 sample이 없는 부분에 붙는다. 그러면 antibody를 처리하였을 때 antibody가 membrane에 붙을 공간이 없어지게 된다. 

 

6. Antibody incubation

 

종류 

monoclonal antibody

하나의 epitope에 반응하고 분자구조가 동일한 하나의 B림프구에서 만들어진 한 종류의 항체이다.

발현성이 높은 단백질 detection에 사용되고 정확한 target binding을 필요로할 때 사용된다. 

주로 단백질 구조 분석, 세포 신호 전달에서 사용. 

 

polyclonal antibody

여러 epitope에 반응하고 (target은 하나) 여러 종류의 B림프구에서 분비된 항원 결정기가 일정하지 않은 여러 종류의 항체이다. 

발현성이 낮은 단백질 detection에 사용되고 주로 IP 실험할 때 항체와 항원의 결합을 최대화 하기 위해 사용된다. 

 

(그러나 뭐 일단 실험하는 입장에서 그냥 있는 거 쓴다!)

 

1차 antibody (primary antibody)

Host species 또는 immune cell culture가 detection 하고자 하는 protein에 노출되었을 때 만들어 진다. 특정 단백질만을 검출하는 primary 생산이 어렵기 때문에 두가지 antibody를 사용한다.

 

2차 antibody (Secondary antibody)

Primary 로 사용한 antibody host에 따라 secondary antibody를 선택한다.

끝 부분에 HRP (Horse radish peroxidase)가 결합되어 있어 이를 화학적으로 처리하여 나오는 빛을 통해 band를 검출하게 된다. (HRP 외 AP, Biotin, Dylight 488, 694도 쓰인다.) 

 

 

7. detection and visualization

western blot의 마지막 단계 detection!

아주 다양한 방법들이 있는데 상황에 맞게 선택하여 band detection을 하도록 한다. 

 

proteintech https://www.ptglab.com/support/western-blot-protocol/choosing-the-right-western-blot-detection-method/

 

	Sensitivity	multiplexing	enzyme	substrate	stability
Enzymatic:Colorimetric	Low	Possible	AP advised	Various	Hours
Enzymatic:Chemiluminescent	Highest	Only with re-probing	HRP advised	Luminol based	Hours
Fluorescent	Low	Easy	None	None	Months-years

실험실에서 주로 사용하는 것은 HRP

HRP란 Luminol과 같은 substrate를 산화시키는데 산화된 luminol은 excited state가 되었다가 ground state로 되면서 그때의 에너지를 빛을 통해서 방출시킨다. 방출된 에너지는 film 감광이나 빛으로 방출되는 에너지 파장을 검출함으로써 확인할 수 있다.