CRISPR - Cas9 system / Knock out cell line 만들기 (1) sgRNA design

이 포스팅은 CRIPSR Cas system 을 이용하여 knock out cell line 만들기에 대한 포스팅이다. 

이론에 관한 것은 잘 정리된 것이 너무 많기 때문에 PASS하고 cell line 만들 때 고려해야 하는 점등을 위주로 포스팅을 해보려고 한다.  

 

CRISPR (clustered  regularly interspaced short palindromic repeats) 는 prokaryoic organism 에서 발견되는 DNA sequence 이다. 박테리아에 파지나 플라스미드가 들어오게 되면 외부 DNA 조각을 박테리아 유전체 속 반복 서열 사이에 넣게 된다. 이 때 이 반복된 서열을 CRISPR 라고 하며 Cas (CRISPR-associated) proteins이 이를 인지하고 pthogenic DNA를 자르게 된다. 이러한 prokaryotic immune system이 CRISPR-Cas system이다. 요즘은 genome engineering 에 활발하게 사용되고 있으며 기초 연구 뿐만 아니라 질병의 치료 등에도 도움이 되고 있다.  

 

CRISPR-Cas system을 이용한 genome editing 을 위해서는 guide RNA (gRNA or sgRNA) 와 Cas protein 이 필요하다. 

 

Guide RNA 디자인을 위해서는 PAM sequence가 근처에 있는 20nt 정도의 unique한 sequence를 찾아야한다. 

 

  출처 wikipedia 

 

간단하게 말하자면 PAM sequence를 가지고 있는 uniqe한 sequence를 sgRNA vecotor에 넣어주면 

target sequence가 edit 하고자하는 유전자에 붙게 되고 sgRNA vector 에 있는 guide RNA 가 Cas9을 불러온다. 

PAM sequence는 Protospacer Adgacent Motif 로서 Cas9 단백질이 이를 인지하고 PAM sequence 5nt 앞 정도에서 gene cleavage가 일어난다. (하지만 non-homologous end joining, homology directed repair 등을 통하여 얼마나 많은 sequence의 edit이 일어날 지는 예측하기 어렵다.) 

가장 기본적은 PAM sequence는 5'-XGG-3' 이고, 요즘은 Cas9 system 뿐만 아니라 Cas12a 등 다른 Cas protein을 사용하는 데 이에 따라 PAM sequence 도 달라진다.  

 

PAM sequence가 있는 sequence를 찾았다면 그 sequence가 다른 genome을 target 하지는 않는지 Blast 등을 통하여 확인해보아야 한다.

 

요즘에는 target sequence를 찾아주는 사이트가 많아서 이를 이용하면 매우 편하고 좋다.

 

CHOPCHOP

기억나는 사이트는 이것뿐이다. (이름이 귀여워가지고..) 아무튼 

google에 CRISPR design tool 이라고 검색하면 여러가지 나온다. 

 

chopchop을 살펴보자면~  

 

 

이렇게 깔끔한 화면을 만날 수 있다. 

Target에 원하는 gene 이름이나 sequence를 넣으면 된다.

Cas9 뿐만 아니라 다양한 system에도 사용이 가능하고 knock-out / knock-in 등 다양한 용도로 사용이 가능하다. 

 

이 사이트 뿐만 아니라 두세가지 사이트에서 공통적으로 추천하는 sequence를 사용하면 knock-out 효율을 높일 수 있다. 

 

그리고 여기서 target sequence를 찾으면 blast를 돌려서 다른 gene을 target 하고 있지는 않은지 한번 더 확인해주면 좋다. 

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

 

sequence를 넣어주면 align 되는 sequence가 나온다. 그 때 내가 target 하는 유전자만 나오는 것이 좋다. 

 

 

 

그리고 sequence에 대해서 고려해야 할 점이 또 있다. 

 

gene card 등을 통하여 내가 edit 하고자 하는 gene이 어떤 isoform 이 존재하고 있는지 확인하고 

가장 공통적으로 포함되는 exon을 target 하는 것이 좋다. 

 

GeneCards - Human Genes | Gene Database | Gene Search

 

gene card에서 alternative splicing pattern을 확인할 수 있다. 이 때 splicing variant 에서 공통적으로 포함되는 exon을 target하면 좋다. 

 

물론 중요하다고 알려진 domain의 sequence를 target 하는 것도 좋음!

그리고 뒷부분보다는 앞부분을 target 을 target하면 좋다. 

 

 

sgRNA design 에 대해서 정리를 하자면~ 

1. PAM sequence (Cas9의 경우 5'-XGG-3')  

2. uniqe sequence -> Blast (ncbi) 

3. isoform / common exon -> gene card 

4. target sequence location / domain 

 

 

이렇게 target sequence를 골랐다면 sgRNA vector에 cloning을 하여야 한다.

보통 sequence가 20개 내외기 때문에 primer annealing을 통하여 insert를 만들고 sgRNA vector에 ligation 하면 된다. 

sgRNA vector 종류도 lentiviral, transient expression 등 다양하게 있다. 

이때 주의해야 할 점은 sgRNA에 들어가는 sequence에는 PAM sequence는 포함이 되지 않는다는 점이다. sgRNA에 넣는 sequence 에 PAM sequence 가 있으면 cas9이 sgRNA를 자를 수 있기 때문이다.

 

여기에 추가적으로 reporter system을 이용하여 gene edit이 잘 이루어 지고 있는지 확인할 수도 있다. 

(Cas9 에 의하여 edit 되면 Red fluorosence가 나온다던지) 

 

sgRNA vector cloning이 끝나면 knock-out 시키고자 하는 cell line에 sgRNA와 Cas9을 넣어주면 된다. 여기에 reporter gene 이 있다면 그것도 함께!