* 시작하기 전
Protein 발현 위치를 확인 à protein atlas 등을 이용하여 tissue 별 보고자 하는 protein expression level check
Protocol
A. Deparaffinization
사용할 만큼 EtOH가 충분한지 check 하고 시작.
중요한 sample 은 fresh 한 EtOH를 사용하면 좋음.
통이 필요한 개수만큼 없기 때문에 100% 통에 95%를 넣어서 사용.
중간 쉬는 시간이 없기 때문에 모두 준비해서 시작.
1. Bake the slide at 60℃ for 30 min. -> 가는 동안 paraffin이 굳는 것을 방지하기 위하여 Xylene I 통을 가져와서 바로 넣기. *toxic하니까 주의!
2. Xylene I, 5 min. (Xylene은 재사용이 가능하고 잘 바꾸지 않는다.)
3. Xylene II, 5 min. (휴지에 물기를 털어주면서 이동)
4. Xylene III, 5 min.
5. Hydrate with EtOH, each step takes 5 min.
(100% EtOH I à 100% EtOH II à 95% à 90% à 80% à 70%)
6. Rinse in dH2O. (비커에 준비) – sample 이 마르면 background가 증가할 수 있으므로 마르지 않는 것이 중요하다.
7. Peroxidase blocking (3% H2O2 in Methanol) – to remove endogenous HRP.
i. Sample 당 약 200 ul 정도 필요함. (6 ul H2O2 + 200 ul Methanol) – 남았을 때 바로 버리지 말고 증발했을 때를 대비하여 남겨놓기.
ii. Solution 처리할 때 hydrophobic boundary 그림.
8. Rinse in dH2O for 10 min at RT. à buffer heating 시작.
i. Chamber에 꽂아서 그대로 비커에 넣어서 shaking.
B. Antigen retrieval
1. Tris-EDTA buffer, pH9.0 온도 높이기
i. 500 ml 기준으로 랩 씌워서 전자레인지 6 min (1L 비커 사용!)
ii. Hot plate 330 ℃ heating! – setting 되어 있음.
iii. Antigen retrieval 은 최소 95℃가 되어야 하므로 보글보글 하면 넣기 *랩 씌우지 말 것.
2. Boiled buffer에 slide 넣고 incubation for 25 min.
3. Run cold tap water into it for 10 min.
C. Immunohistochemical staining.
1. Hydrophobic boundary 다시 그리기
i. buffer 바뀌거나 약해질 때 마다 check 하고 그리는 것이 좋음.
ii. tissue 긁히지 않는 것이 가장 중요.
2. Blocking
i. 2% BSA + 10% goat serum in 0.3% PBST (0.3% triton-100). – 5% BSA in PBS OK.
ii. Incubation for 30 min at RT in humidifying chamber.
3. Primary antibody staining.
i. Incubation for O.N. at 4 ℃. (마르지 않게 check!!)
4. Rinse with 0.3% PBST for 10 min X3 on the orbital shaker.
5. Secondary antibody staining.
i. Incubation for 1 h at RT.
6. Rinse with 0.3% PBST for 10 min X3 on the orbital shaker.
i. 비커에 물을 담아서 sample을 넣고 이동.
D. DAB staining
1. Incubation in DAB solution at RT for 10 min.
i. Boundary 그리기!
ii. 처리 시간을 sample 별로 조절하는 것이 중요함.
iii. 보면서 staining 되는 지 check 하고 그 시간에 맞춰서 다른 sample을 확인할 것.
iv. Maximum 30 min, 해도 안 되면 antibody 농도를 높이는 것이 필요하다.
2. Rinse in DW.
i. 물에 넣으면 DAB staining 반응 끝!
3. Counter staining (filtered Mayer’s Hematoxylin) for 3 sec.
i. Paper filter 이용하여 filter
ii. 100 ml 필요, 모자라면 filter paper 버리기 전에 더 부어서 준비.
iii. Slide 물 털고 staining 진행.
iv. 통은 한번 씻어서 두기.
4. Rinse in DW, running Tap water for 5 min.
i. Dilution 된 염색약이 머무르지 않도록 주의.
5. Incubation in 1X TBST for 2 min
6. Rinse in running tap water for 1 min.
7. Dehydrate through 70% EtOH for 3 min.
8. 95% EtOH 3 min. (낮은 % 에서 높은 %로 갈 때, 희석될 수 있으므로 주의.)
9. 95% EtOH 3 min.
10. 100% EtOH II 3 min.
11. 100% EtOH I 3 min.
12. Xylene III 3 min.
13. Xylene II 3 min.
14. Mounting -cover the slide with mounting solution.
i. Xylene에 녹는 것, 수용성 – 보통 xylene에 녹는 것 사용.
ii. 스포이드 준비하여 한 방울 떨어뜨리기.
iii. Slide 하나씩 진행하는데 그 다음 slide는 xylene에 있는 상태로 둘 것. 노출 X!
iv. Bubble은 깨끗한 tip으로 눌러서 제거
v. 끈적해서 tip 끝이나 장갑에 묻을 수 있으므로 주의, 특히 cover glass 위에 묻지 않게 주의.
vi. Edge에 넘친 mounting solution은 휴지에 눌러서 제거.
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