DNA Mini prep (plasmid prep) 레시피, 원리

Material 

SolutionⅠ (50 mM glucose, 25 mM Tris HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0))

Solution Ⅱ (0.2 N NaOH , 1% SDS)

Solution Ⅲ (5 M Potassium acetate, Glacial acetic acid)

 

or 

 

SolutionⅠ (50 mM Tris HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0))

Solution Ⅱ (0.2 N NaOH , 1% SDS)

Solution Ⅲ (3 M Potassium acetate (pH5.5), Glacial acetic acid)

 

Recipe

SolutionⅠ

Tris base 6.06 g

Na2EDTA2H2O 3.72 g

in 800 ml dH2O

Adjust pH 8.0 with HCl 

Adjust volume to 1 L 

 

Solution Ⅱ

8.0 g NaOH in 950 ml dH2O

20% SDS 50 ml

 

Solution Ⅲ

294.5 g potassium acetate in 500 ml dH2O

Adjust pH to 5.5 with glacial acetic acid (~110 ml)

Adjust volume to 1 L

 

 

*SolutionⅠ에 100ug/ml of RNase A 추가! 

SolutionⅠ (50 mM glucose, 25 mM Tris HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0))

- EDTA : 거의 모든 금속이온과 안정한 수용성 킬레이트를 형성한다. 세포벽의 integrity를 유지하는데 필수적인 calcium ion을 제거하여 균열이 생기면서 세포벽이 무너진다.

- 이 때 세포를 증류수나 기타 낮은 농도의 용매에 넣어두면 삼투압 현상이 일어나며 세포가 완전히 깨지게 된다. Glucose는 이것을 억제한다. 즉 glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지하는 역할을 한다. Vortex를 하였을 때 세포가 완전히 깨져버리게 되면 choromosomal DNA가 잘게 깨지면서 Plasmid DNA와 구분할 수 없게 된다.

- Lysozme을 넣기도 하는데 이는 세균의 세포벽에 있는 다당류의 n-NAM과 n-NAG 사이의 b-1, 4-글리코시드결합을 가수분해하는 효소로 세포벽의 분해를 돕는다.

- 4℃ 보관

Solution Ⅱ (0.2 N NaOH , 1% SDS)

- SDS는 ionic detergent로 세포막을 깨는 일을 한다. (lysis)

-  NaOH는 강한 염기성이며 세포가 깨지면서 DNA가 밖으로 나왔을 때 DNA를 변성시킨다.  (크기가 작은 supercolied plasmid DNA는 그다지 심각하게 변성되지 않는다)

-  Sol 2를 넣고 잘 섞어주게 되면 세포가 깨지면서 세포 안의 물질들이 흘러나와서 끈끈하면서 투명한 suspension이 된다.

- 이때 vortex는 사용하지 않으며 invert한 후 10분 정도 기다리면 좋다.

- SDS가 들어있으므로 25℃ 보관

Solution Ⅲ (5 M Potassium acetate, Glacial acetic acid)

- 산성 용액으로 염기성이 된 용액을 다시 중성으로 돌려 놓으며 변성된 DNA를 renature 시키는 역할을 한다.

- Sol 2를 처리 한 후 너무 오랫동안 놓아두면 다시 renature되는 것이 힘들어지므로 시간을 잘 지켜 실험을 진행해야 한다.

- Sol 3를 처리하면 choromosomal DNA 및 potassium, SDS의 complex인 침전물이 생기는 것을 관찰 할 수 있다.

- 4℃ 보관